Laboratoryjne metody diagnostyki zakażeń Clostridioides difficile jako ważny aspekt w leczeniu i kontroli CDI

Test neutralizacji cytotoksyczności CCNA

Test CCNA jest uważany za tzw. „złoty standard” w wykrywaniu toksyn i potwierdzeniu wystąpienia CDI. Wykrywa on toksynę B w kale lub szczepie bakteryjnym. Metoda ta polega na ujawnieniu efektu cytopatycznego w hodowli komórkowej, który jest neutralizowany przez obecność przeciwciał przeciwko toksynom C difficile. W tym teście przygotowany filtrat kału lub zawiesina bakteryjna czy też hodowla płynna jest nanoszona na jednowarstwową linie komórkową (np. linia komórkowa Vero, fibroblastów ludzkich lub innej). Hodowle te są badane pod mikroskopem po 24–48 godzinach inkubacji w poszukiwaniu dowodów efektu cytopatycznego (CPE) – zaokrąglenie, liza komórek spowodowane apoptozą. W przypadku zaobserwowania efektu cytopatycznego przeprowadza się test neutralizacji, aby potwierdzić, że uzyskany efekt jest wynikiem obecności toksyn C. difficile, a nie jest spowodowany innymi czynnikami. Do filtratu dodaje się antytoksynę C. sordelli lub C. difficile (przeciwciała neutralizujące CPE). Brak występowania CPE świadczy o obecności toksyn C. difficile w kale. Ze względu na brak standaryzacji metody, dość długi czas oczekiwania na wynik oraz złożoność procesu diagnostycznego test ten nie jest powszechnie stosowany (11, 12, 13).

Testy immunoenzymatyczne na obecność toksyny C. difficile (EIA)

Testy te opierają się na zastosowaniu przeciwciał mono- lub poliklonalnych do wykrywania toksyn A i/lub B obecnych w próbce kału. Ze względu na ich prostotę, niski koszt i szybki czas wykonania przez kilka lat cieszyły się one dużą popularnością. Testy EIA na obecność toksyn A/B są dostępne w wielu wariantach: mikrostudzienki z fazą stałą, szybkie testy chromatopolarograficzne, testy przepływu bocznego, kasetkowe testy immunoenzymatyczne oraz systemy zautomatyzowane wykorzystujące techniki enzymatycznofluorescencyjne (ELFA) lub metody immunochemiluminescencji (ECLIA). Testy EIA wykrywające toksyny zapewniają dobrą specyficzność kliniczną u pacjentów z objawami, ale nie są wystarczająco czułe, aby wykluczyć zakażenie CD, a obecność toksyn nie zawsze koreluje z prawdziwym zakażeniem CD, zwłaszcza jeśli badani są bezobjawowi nosiciele lub pacjenci po wyleczonym zakażeniu. Wykazano, że niektóre testy EIA toksyny A/B mają niski PPV w diagnozowaniu CDI, zatem nie są one rekomendowane jako samodzielne testy diagnostyczne (11, 12).

Testy wykrywające dehydrogenazę glutaminianową (GDH)

GDH jest enzymem wytwarzanym przez toksynotwórcze jak i nietoksynotwórcze szczepy C. difficile i bierze on udział w szlakach metabolicznych bakterii. Testy w kierunku GDH są dostępne w różnych wersjach: testy immunoenzymatyczne EIA, membrany przepływu bocznego, systemy zautomatyzowane ELFA/CLIA. Co więcej posiadają wiele zalet m.in. są szybkie, tanie i łatwe w wykonaniu w porównaniu do testów NAAT.

Cechują się wysoką czułością (> 90%) i wysokim NPV wykazanym w wielu pracach przeglądowych i metaanalizach, co pozwoliło uczynić je pierwszym testem przesiewowym w dwu- lub trzyetapowym algorytmie razem z wykonaniem testu w kierunku obecności toksyn w kale (14). Na rynku są również dostępne testy kombinowane wykrywające jednocześnie antygen GDH i toksyny A i/lub B w kale. W przypadku stosowania powyższego rozwiązania, próbki kału dające wynik GDH i toksyny A/B ujemny podajemy jako wynik negatywny, natomiast w przypadku GDH i toksyn dodatnich wynik podajemy jako pozytywny. Inaczej, gdy antygen GDH jest dodatni, a toksyny ujemne próbka powinna być skierowana do dalszych badań molekularnych lub oznaczeń CNNA/TC, aby wykluczyć CD (11, 12, 15).

Testy molekularne NAAT

Testy NAAT oparte są o łańcuchową reakcje polimerazy (PCR), również o izotermiczne amplifikacje DNA za pośrednictwem tzw. pętli (LAMP – loop mediated isotermal amplification), a także amplifikacje zależne od helikazy (HAD – helicase dependent amplification). Pierwsze testy molekularne zatwierdzone przez FDA są dostępne od 2009 roku. Obecnie dostępnych jest przynajmniej 12 testów, które wykrywają częściej pojedynczy, rzadziej obydwa geny kodujące toksyny A/B C. difficile (tcdA, tcdB) oraz toksynę binarną (tcdC) a także delecję 117 nukleotydu genu tcdC. Są to szybkie, precyzyjne metody charakteryzujące się wysoka czułością (95%)
i swoistością (98%), a także stają się coraz bardziej popularne w rutynowej diagnostyce CDI. Metody molekularne wymagają użycia specjalistycznej aparatury i odczynników, obligują do wysokiego poziomu wiedzy technicznej przez personel medyczny, dodatkowo są kosztowne w porównaniu z innymi metodami, a co za tym idzie są często niedostępne szczególnie w mniejszych laboratoriach. Testy molekularne pomimo swoich zalet nie nadają się do stosowania w rutynowej diagnostyce jako samodzielny test, ponieważ nie wykrywają one obecności toksyn tylko geny je kodujące, a u pacjentów skolonizowanych szczepem toksynotwórczym C. difficile, biegunka może wystąpić również z innych powodów. Należy, więc pamiętać że NAAT’s wykazują niską wartość predykcyjną i zależą od zapadalności i granicy wykrywalności testu, a ich nieodpowiednie użycie w procesie diagnostyki może doprowadzić do niepotrzebnego leczenia (13).

Podsumowanie

Laboratoryjna diagnostyka CDI może okazać się wyzwaniem z powodu braku jednego złotego standardu, który mógłby być wykonywany rutynowo w laboratoriach medycznych.

Diagnostyka CDI opiera się na dwu lub trzystopniowym algorytmie postępowania, co pozwala zwiększyć dokładność postępowania diagnostycznego.

Bez względu na zastosowaną metodę, poprawne wykorzystanie testów jest kluczowym elementem w prawidłowym procesie diagnostycznym. Kluczowe wydaje się być także uzgodnienie instytucjonalne pacjentów zakwalifikowanych do badań w kierunku C. difficile, aby zapobiec negatywnym skutkom wykrycia przypadków kolonizacji i ich dalszego leczenia.

Precyzyjna i szybka diagnostyka CDI jest niezwykle ważna, aby móc wdrożyć odpowiednie leczenie, rozpocząć szereg procedur związanych
z kontrolą zakażeń oraz zapobiec rozprzestrzenianiu się zakażeń C. difficile
w środowisku szpitalnym.

Piśmiennictwo:

1. Albrecht P., Pituch H.: Clostridium difficile — narastający problem diagnostyczny i terapeutyczny. „Onkologia w Praktyce Klinicznej”, 2013, tom 9, nr 1, 22–31.
2. http://wwwold.pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/2022/INF_22_12B.pdf
3. Jurkowska G., Kostrzewska M., Świdnicka‑Siergiejko A.: Zakażenie Clostridium difficile – diagnostyka i leczenie. „Gastroenterologia Praktyczna”, 2014, 3 (24), 61-74.
4. Szewczyk E. M.: „Diagnostyka bakteriologiczna”, Warszawa PWN 2019.
5. Martirosian G., Hryniewicz W., Ozorowski T., Pawlik K., Deptuła A.: Zakażenia Clostridium (difficile): epidemiologia, diagnostyka, terapia, profilaktyka. „Narodowy Program Ochrony Antybiotyków na lata 2016-2020”. Ministerstwo Zdrowia, Warszawa 2018: http:/www.antybiotyki.edu.pl.
6. Fleischer-Stępniewska K., Szczepanek M., Rymer W., Bartnik W.: Zakażenie Clostridioides difficile i rzekomobłoniaste zapalenie jelit. „Interna Szczeklika” (Mały podręcznik).
7. Song J.H., Kim Y.S.: Recurrent Clostridium difficile infekction: Risk Factors, Treatment and Prevention. „Gut Liver”, 2019;13(1):16 – 21.
8. Piekarska A., Panasiuk A., Stępień P.M.: Postępowanie w zakażeniach Clostridioides (Clostridium) difficile wraz z zasadami transferu mikrobioty jelitowej – Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i lekarzy chorób zakaźnych. „PRZEGL EPIDEMIOL” 2020;74(1): 69-87.
9. Gateau C., Cauturier J., Coia J., Barbut F.: How to: diagnose infection caused by Clostridium difficile. „Clin Microbiol Infect” 2018;24: 463 – 68.
10. Aptekorz M., Martirosian G.: Metody mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń Clostridium difficile. „Med. Dośw. Mikrobiol.”, 2017, 69: 177-185.8.
11. Somily A.M., Khan M.A., Morshed M.: The Laboratory Diagnosis of Clostridioides difficile Infection: An update of current laboratory practice. Review. „J Infect Dev Ctries” 2021; 15(10):1364- 1375. doi:10.3855/jidc.13217.
12. Carroll K.C., Mizusawa M.: Laboratory Tests for the Diagnosis of Clostridium difficile. „Clin Colon Rectal Surg” 2020;33:73–81.
13. Planche T., Wilcox M:. Reference assays for Clostridium difficile infection: one or two gold standards? „J Clin Pathol”: first published as10.1136/jcp.2010.080135 on 30 November 2010.
14. Arimoto J., Horita N., Kato S., i inni.: Diagnostic test accuracy of glutamate dehydrogenase for Clostridium difficile: systematic review and meta-analysis. „Sci Rep” 2016;6:29754.
15. Vasoo S., Stevens J., Portillo L., Barza R., Schejbal D., Wu M.M., Chancey C., Singh K.: Cost effectiveness of a modified two-step algorithm using a combined glutamate dehydrogenase/toxin enzyme immunoassay and real-time PCR for the diagnosis of Clostridium difficile infection. „J Microbiol Immunol Infect” 2014, 47: 75-78.

Czytaj też: Jakie problemy i wyzwania stoją aktualnie przed polską diagnostyką laboratoryjną?